Am 27. Oktober 1932 wurde die neue Pinakothek vom Architekten Luca Beltrami auf Wunsch und gemäß den Vorschriften Papst Pius’ XI. errichteten Bau eingeweiht. Das Gebäude befindet sich abgelegen und völlig von Alleen umgeben, innerhalb des Stadtteils „Giardino Quadrato“ aus dem 19. Jahrhundert. Man hielt es dafür geeignet, optimale Lichtverhältnisse zusammen mit einer korrekten Erhaltung der Werke und einer optimalen ästhetischen Wirkung zu garantieren.

Auf diese Weise wurde das jahrelange Problem der Ausstellung der Gemälde gelöst, die ständig innerhalb der Apostolischen Paläste ihren Standort wechselten, da es an geeigneten Räumlichkeiten fehlte. Eine erste Sammlung von nur 118 wertvollen Gemälden richtete 1790 Papst Pius VI. ein; allerdings war sie nur von kurzer Dauer, da infolge des Traktates von Tolentino (1797) einige der größten Meisterwerke nach Paris verschleppt wurden.

Die Idee einer Pinakothek im modernen Sinne als ein der Öffentlichkeit zugänglicher Ausstellungsraum entstand erst 1817 nach dem Fall Napoleons und der darauffolgenden Zurückgabe des größten Teils der Kunstwerke an den Kirchenstaat, wie es am Wiener Kongress bestimmt hatte.

Die Sammlung wurde im Laufe der Jahre durch weitere geschenkte oder ergatterte Werke bereichert und zählt heute etwa 460 Gemälde, die nach chronologischen Kriterien bzw. nach den Schulen auf die 18 Säle, ausgehend von der frühitalienischen Malerei (12.-13. Jh.) bis zum 19. Jahrhundert verteilt sind. Vertreten sind hier Meisterwerke der berühmtesten Persönlichkeiten der italienischen Kunstgeschichte, darunter Giotto, Beato Angelico, Melozzo da Forlì, Perugino, Raffael, Leonardo, Tizian, Veronese, Caravaggio und Crespi.