La nouvelle Pinacothèque Vaticane fut inaugurée le 27 octobre 1932 dans le bâtiment construit à cet effet par l'architecte Luca Beltrami, sur ordre et selon les directives du pape Pie XI. Ce bâtiment se trouvait dans une partie du Jardin Carré du XIXe siècle, lieu à la fois isolé et entièrement bordé d'allées, que l'on jugeait apte à assurer les meilleures conditions lumineuses, tant du point de vue de la conservation des œuvres que de leur valorisation.

Ainsi fut résolue l'épineuse question relative à l'exposition des peintures, continuellement déplacées dans les Palais Apostoliques, en l'absence d'un lieu pouvant accueillir un si grand nombre d'œuvres. Vers 1790, le pape Pie VI rassembla une première collection de 118 peintures mais celle-ci eut une courte existence car à la suite du Traité de Tolentino (1797) une grande partie des plus grands chefs-d'œuvre fut transférée à Paris.

L'idée d'une Pinacothèque, comme on l’entend aujourd’hui, donc une exposition ouverte au public, ne naquit qu’en 1817 après la chute de Napoléon. Conformément aux directives du Congrès de Vienne, une grande partie des œuvres appartenant à l'Etat de l'Eglise lui fu restituée.

La collection se développa au fil des ans à travers des donations et acquisitions jusqu'à atteindre le chiffre actuel d'environ 460 peintures, exposées dans dix-huit salles, par ordre chronologique et selon les écoles, des Primitifs (XIIe-XIIIe siècles) au XIXe siècle. La collection comprend des chefs-d'œuvre des plus grands artistes de la peinture italienne parmi lesquels Giotto, Fra Angelico, Melozzo da Forlì, le Pérugin, Raphaël, Léonard de Vinci, Titien, Veronese, Caravage et Crespi.